嚙齒類(lèi)實(shí)驗動(dòng)物的遺傳質(zhì)量控制應該和微生物質(zhì)量控制一樣作為實(shí)驗動(dòng)物設施質(zhì)量控制計劃的重要組成部分。

本文由FELASA實(shí)驗小鼠遺傳質(zhì)量控制和遺傳監測工作組提出，描述了動(dòng)物設施嚙齒類(lèi)動(dòng)物遺傳質(zhì)量控制計劃的目標和可用方法。

遺傳質(zhì)量控制計劃的主要目標是：

(a)驗證近交系及亞系的真實(shí)性和一致性，從而確保遺傳上的可靠性；

(b)檢測可能的基因污染；

(c)精確描述遺傳系的遺傳組成。

雖然本文主要關(guān)注小鼠和大鼠的遺傳質(zhì)量控制，但這些原則也適用于其他嚙齒類(lèi)動(dòng)物。

（一）標準化實(shí)驗嚙齒類(lèi)動(dòng)物

01、近交系

國際小鼠標準化遺傳命名委員會(huì )和大鼠基因組命名委員對近交系的定義是：一個(gè)品系經(jīng)歷了至少連續20代的兄弟姐妹交配或親子交配，且品系內所有個(gè)體都可追溯到起源于第20代或以上代數的一對共同祖先，即為近交系。

此時(shí)，種群內的動(dòng)物平均剩余雜合度≤2%，個(gè)體可視為基因相同。據估計，兄弟姐妹交配需要24代才能達到雜合度< 1%，需要36代才能達到(幾乎)完全同源。

同源性意味著(zhù)相同的組織相容性（抗原），意味著(zhù)品系內每個(gè)個(gè)體的基因都相同，一個(gè)品系的任意個(gè)體可以永久接受來(lái)自同一品系和性別的任何個(gè)體的組織移植。與克隆動(dòng)物和同卵雙胞胎(所有基因組位點(diǎn)100%相同)不同，近交系嚙齒類(lèi)動(dòng)物除了是等基因的，在幾乎所有的基因組位點(diǎn)上也都是純合子。

總的來(lái)說(shuō)，每個(gè)近交系都代表一個(gè)隨機但獨特的等位基因組合。如果用同樣的初始動(dòng)物從零開(kāi)始重新培育一個(gè)品系，經(jīng)過(guò)同樣的20代近親繁殖，所產(chǎn)生的品系在遺傳上一定不同于原來(lái)產(chǎn)生的那一個(gè)。

常見(jiàn)的近交系小鼠品系包括:A/J、BALB/c、C3H/He、C57BL/6、DBA/2、FVB/N等;大鼠品系包括:ACI、BN、F344、LE、WKY等。

02、遠交系

遠交系是指在一固定的群體內，以非近親交配方式育成的動(dòng)物品系，且連續15 代不從外部引入新的動(dòng)物種群。

遠交系不同于近交系，因為它們的基因是異質(zhì)的，也就是某一動(dòng)物的遺傳結構是從這個(gè)遠交系遺傳基因庫中隨機抽取的，而不是已知的。不過(guò)，一個(gè)遠交系群體中的所有動(dòng)物都具有相同的群體特征，例如白化病。遠交群具有良好的繁殖能力及與其他品系相比相對溫和等優(yōu)點(diǎn);這些特征使得這些動(dòng)物成為輔助生殖實(shí)驗中代孕母鼠的優(yōu)質(zhì)候選動(dòng)物。

遠交系小鼠有ICR (CD-1)、CFW和NMRI(都是從Clara J. Lynch于1926年進(jìn)口到美國的原始“Swiss”小鼠衍生而來(lái))和(non-Swiss)CF-1。遠交系大鼠有Sprague Dawley (SD)、Wistar (WI)和Long-Evans (LE)。

由于遠交系在遺傳上的多樣性，通常基于評估預期的表型性狀來(lái)做遺傳質(zhì)量控制，如基于商業(yè)繁育的大型群體通過(guò)基礎數據分析動(dòng)物的毛色、生長(cháng)和繁殖特征等信息來(lái)完成遺傳監控。由于遠交系和人類(lèi)群體一樣是異質(zhì)的，它們經(jīng)常被用于毒理學(xué)和藥理學(xué)研究。然而，也有遺傳學(xué)家對這樣的應用提出了質(zhì)疑，并批評了一些研究不恰當地使用了遠交系小鼠，在次優(yōu)實(shí)驗中浪費了動(dòng)物的生命和寶貴的資源。

（二）其他標準化品系的小鼠和大鼠

雜交一代小鼠（F1）是由兩個(gè)獨立的近交系雜交產(chǎn)生的，在親本系擁有不同等位基因的所有位點(diǎn)上都是雜合的。F1同窩仔鼠基因相同，具有組織相容性。

同源導入近交系（congenic inbred strain），也稱(chēng)近交同類(lèi)系，是由兩個(gè)品系雜交產(chǎn)生的:攜帶特定等位基因或染色體區域的供體品系和將接受該位點(diǎn)的受體品系進(jìn)行雜交，產(chǎn)生的F1后代回交到受體品系，鑒定出攜帶該等位基因的后代，并再次回交到受體品系。通常這個(gè)過(guò)程需要重復10個(gè)或更多的連續代次(圖1)。重復回交會(huì )讓受體品系除了攜帶指定等位基因的染色體區域以外的的染色體逐漸取代供體品系的染色體。

圖1：建立同類(lèi)系的步驟

第一步是在攜帶特定基因的供體品系(例如，白化品系)和受體品系或背景品系(例如，黑色品系)之間進(jìn)行雜交。在每一代中，一個(gè)攜帶特定基因(*)的動(dòng)物被回交給受體品系(遺傳連接基因被轉移，滲入片段的大小可以是數千或數百萬(wàn)個(gè)堿基，并包括許多基因)。灰色的程度增加表明每回交一代后后代的背景基因組數量增加。當修飾后的基因沒(méi)有產(chǎn)生易于識別的表型(例如皮膚或行為改變)時(shí)，就需要通過(guò)分子生物學(xué)方法做基因分型鑒定，以選出合適的載體(雜合)小鼠。

遺傳工程嚙齒動(dòng)物

通常有兩種不同的方法來(lái)表征基因功能：

（1）正向遺傳學(xué)(從表型到基因型)旨在描述導致特定突變表型的基因改變(通常來(lái)自自發(fā)或化學(xué)誘導突變)。

（2）反向遺傳學(xué)，旨在通過(guò)分析通常由研究人員在DNA水平上設計的在表型水平上顯現的后果來(lái)描述基因的功能。

本節簡(jiǎn)單介紹了幾種獲得GA嚙齒動(dòng)物的基本方法：

(a)顯微注射法，(b)載體介導的轉基因，(c)胚胎干細胞中的同源重組，(d)基因編輯核酸酶，以及(e)化學(xué)誘導或自發(fā)突變。這些制備技術(shù)都有詳細描述并已經(jīng)公開(kāi)發(fā)表，因此本文不作詳細描述。在使用基因編輯技術(shù)來(lái)創(chuàng )建轉基因動(dòng)物之前，首先應該檢查已有的數據庫來(lái)確定是否已經(jīng)存在合適的動(dòng)物模型，例如由杰克遜實(shí)驗室和國際小鼠表型聯(lián)盟管理的數據庫。

（a）顯微注射法轉基因

首批顯微注射轉基因小鼠誕生于20世紀80年代初。是將改造后的目的基因或基因組片段用顯微注射法注入供體小鼠的受精卵或著(zhù)床前胚胎細胞，然后植入受體動(dòng)物的輸卵管或子宮中，使其發(fā)育成攜帶有外源基因的轉基因動(dòng)物。目前這種技術(shù)仍然被廣泛使用。

該方法的整合位點(diǎn)是隨機的，因此容易造成基因組重排、易位和缺失。還會(huì )出現多拷貝串聯(lián)整合，并導致外源基因表達率低甚至不表達。

（b）載體介導的轉基因

通過(guò)逆轉錄病毒/慢病毒載體將外源基因連接到長(cháng)末端重復序列下游進(jìn)行基因重組后，再包裝成高滴度病毒顆粒，直接感染受精卵或顯微注射到囊胚腔中，攜帶外源基因的反轉錄病毒DNA就可以整合到宿主染色體上了。

除了逆轉錄病毒載體，預處理過(guò)的攜帶外源基因的精子也被成功地用作載體，在受精過(guò)程中將外源基因導入動(dòng)物胚胎，從而獲得轉基因后代。

每種技術(shù)都有其優(yōu)缺點(diǎn)，例如，病毒載體只能導入較小的外源基因，而精子介導的轉基因技術(shù)則可能影響精子自身的遺傳物質(zhì)質(zhì)量。

（c）胚胎干細胞同源重組靶向誘變

胚胎干細胞介導法是通過(guò)將外源基因導入胚胎干細胞，然后將轉入基因的胚胎干細胞注射入受體動(dòng)物胚胎后，可參與宿主的胚胎構成，形成嵌合體，直至達到生殖系嵌合，并形成子代。

（d）使用核酸酶進(jìn)行基因編輯

在過(guò)去十多年中，一些新的技術(shù)越來(lái)越廣泛地應用于大小鼠和其他物種的靶向突變。例如鋅指核酸酶技術(shù)、TALEN技術(shù)和CRISPR/Cas9技術(shù)等，特別是CRISPR/Cas9技術(shù)，利用sgRNA識別基因特定靶序列，介導Cas9酶定位并剪切基因。當同時(shí)加入同源重組模板時(shí)，即可達到基因導入的目的。CRISPR/Cas9技術(shù)已被用于基因敲入、敲除和點(diǎn)突變。該技術(shù)高度靈活、快速和高效，可以在任何遺傳背景下制造KO和KI系。

然而，這項技術(shù)也需要進(jìn)行廣泛的基因序列分析和篩選，以確保存在所需要的序列，同時(shí)不存在非靶向突變或其他不可預測的更大的基因組改變。

（e）自發(fā)的和化學(xué)誘導的突變

自發(fā)突變可通過(guò)觀(guān)察異常的表型發(fā)現，它有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：首先它們的產(chǎn)生幾乎不需要成本；第二，它們通常有明顯的表型；第三，自發(fā)突變代表了各種各樣的分子事件，如缺失、插入和點(diǎn)突變，不僅產(chǎn)生功能缺失的等位基因，還產(chǎn)生低形態(tài)和高形態(tài)的等位基因；最后，突變產(chǎn)生于各種背景，包括近交系和遠交系。

經(jīng)典的自發(fā)突變模型包括：裸鼠(Foxn1nu )、scid(Prkdcscid )、無(wú)毛小鼠(Hrhr )、糖尿病小鼠(Leprdb )、肥胖癥小鼠(Lepob )和肌肉萎縮癥小鼠(Dmdmdx )以及Rowett裸大鼠(Foxn1rnu )和Zucker糖尿病脂肪大鼠(Leprfa )等。

乙酰基亞硝基脲(ENU)可作為誘變劑應用于小鼠疾病模型的篩選。由于ENU通常產(chǎn)生點(diǎn)突變，它廣泛應用于正向遺傳篩選。ENU誘變的主要缺點(diǎn)是它產(chǎn)生的突變是隨機的而不是靶向突變。

參考文獻：

[1] Benavides F , T Rülicke,  Prins J B , et al. Genetic quality assurance and genetic monitoring of laboratory mice and rats: FELASA Working Group Report:[J]. Laboratory Animals, 2020, 54(2):135-148.