摘要

小鼠尸檢的主要目的是通過(guò)肉眼觀(guān)察確定基因工程小鼠或患病小鼠的解剖特征，并描述導致發(fā)病率和死亡率的病變。為后續檢查采集的組織需要適當處理和保存，以防止變質(zhì)。

因此，高效的常規操作對于促進(jìn)組織學(xué)和確保高質(zhì)量的樣本至關(guān)重要。此外，優(yōu)化技術(shù)最大限度地減少了損壞樣本的數據丟失，減少了使用的動(dòng)物數量，并支持3Rs“reduction”原則。

在本文中，我們提供了一種用于小鼠組織采集的優(yōu)化方法，也包括培訓技巧和注意事項。

前言

小鼠尸檢是一種以系統方式進(jìn)行的死后科學(xué)檢查，能夠觀(guān)察大體解剖并采集組織，作為實(shí)驗終止研究或動(dòng)物健康篩查的一部分。小鼠尸檢在技術(shù)上具有挑戰性，各組操作人員之間的技術(shù)差異可能影響數據的可比性。

因此，制定一個(gè)標準化的方案和密切監測人員培訓非常重要，以保持操作一致性和采集的組織質(zhì)量。簡(jiǎn)單的術(shù)語(yǔ)表有助于確保操作者之間的描述的一致性。

本文中的方法平均需要2個(gè)小時(shí)左右就可以掌握，如果熟練操作，10分鐘左右就能夠完成1只小鼠的解剖操作。在操作組織或化學(xué)試劑時(shí)，需要佩戴適宜的PPEs(防護眼鏡、手套、白大褂和口罩等)。

注意：在解剖實(shí)驗動(dòng)物前，必須進(jìn)行培訓以掌握解剖技巧。

解剖前準備

本文所描述的解剖操作是在兩只16周齡的B6J小鼠（雌雄各1只）上進(jìn)行的。其飼養條件為：IVC飼養，自由采食飼料和飲水，符合動(dòng)物福利。

如果需要生化檢測以補充大體觀(guān)察，在解剖前可進(jìn)行終末采血(全身麻醉后進(jìn)行)。一旦采集了所有必要的樣本，必須對小鼠進(jìn)行放血或使用其他安樂(lè )死方法。采血操作人員必須經(jīng)過(guò)培訓。

采集后的組織置于10%中性緩沖福爾馬林溶液中(10% neutral buffered formalin下文簡(jiǎn)稱(chēng)：10% NBF)，除非有其他要求。一些組織可以放置在無(wú)纖維吸墨紙上，以避免折疊，并便于在包埋和顯微分析時(shí)定位。

提示:10% NBF需要預先準備好，對大多數組織具有良好的固定效果，理想的固定液與組織的比例至少為20:1。固定液體積不足會(huì )導致固定效果不良。

小鼠解剖具體步驟

對小鼠實(shí)施安樂(lè )死。在確認小鼠死亡后(即血液循環(huán)停止)，在解剖前應用70%的酒精浸濕毛皮，以降低過(guò)敏原風(fēng)險。

穿過(guò)腹側皮膚和腹肌，穿過(guò)胸腔的尾緣，在劍骨下方(圖1-A和1-B)，做一個(gè)腹部切口。

然后從兩側向恥骨方向切開(kāi)腹部，然后穿過(guò)尾腹，切除整個(gè)腹側皮膚。切下的腹部皮膚部分平鋪在一張紙上(圖1-C)。

√提示：確保切除的腹部皮膚部分足夠寬，并包含乳腺組織。

使用26G 3/8針頭和5ml注射器吸取10% NBF對腸道和胃部組織進(jìn)行灌注(圖1-D)，以減少自溶，因為小鼠死亡后腸內迅速發(fā)生自溶。

√注意：灌注要適量，否則腸道過(guò)度膨脹可能導致破裂或過(guò)度拉伸。

然后摘下胃腸道。輕輕按住胃，剪斷食道，剝離腸道。剪斷骨盆附近的結腸，盡可能完整的取下整個(gè)胃腸道。

√提示：抬高小鼠軀體可以使胃腸道遠離腹腔，減少剪斷結腸時(shí)損傷其他組織的風(fēng)險。

圖1 (A-S)小鼠尸檢

（am:腹肌；d:膈肌；di:二腹肌；i:腸道；l:肝臟；m:咬肌；o:食管；q:股四頭肌；s:皮膚；sc:脊髓；sg:唾液腺；sn:坐骨神經(jīng)；t:舌頭）

小心剪開(kāi)肋弓到下頜骨的皮膚，以減少對唾液腺和氣管造成損傷(圖1-E)。下頜骨唾液腺附著(zhù)在皮膚上(圖1-F)。

接下來(lái)，從靠近前肢的兩側切開(kāi)胸骨和肋骨，并穿過(guò)兩側鎖骨(圖1-G)。

√提示：剪刀的一個(gè)刀片應該插入胸骨上切口，另一個(gè)刀片插入肋骨和鎖骨外側，避免損傷胸腺或心臟。注意:避免損傷胸骨，因為胸骨可用于評估骨髓。

使用26G3/8針頭通過(guò)氣管緩慢向肺部灌注NBF(圖1-H)。

√注意：避免多次穿孔氣管，因為這會(huì )損傷組織。提示:為了有效進(jìn)行肺部灌注，可以將針頭彎曲成90度或保定小鼠頭部，以形成合適的針頭插入角度。

依次取下舌頭、下頜骨、甲狀腺、氣管、食道、心臟、胸腺和肺。切斷二腹肌和咬肌之間的下頜骨，并輕輕摘取組織器官(圖1-I和1-J)。

一并取下肝臟和膈肌(圖1-K)，操作肝臟時(shí)要輕柔，因為肝臟易碎。

通過(guò)提拉輸尿管并切斷背側連接，取下雙腎及其相伴的腎上腺(圖1-L)。

如果是雄性動(dòng)物，取下兩個(gè)睪丸并放入Hartmann’s固定液中。解剖兩個(gè)附睪并平放在紙上。將精囊、前列腺和膀胱整體切除，平放于紙上(圖2-A至2-D)。

√提示：對于眼睛和睪丸等組織，使用Hartmann’s固定液(改良戴維森)(Cat. H0290-500ML; Merck Life Science)可減少組織收縮和確保足夠的固定。

樣品應在室溫下固定24-72小時(shí)，然后轉移到10% NBF中。

如果是雌性動(dòng)物，應切開(kāi)恥骨，從卵巢到陰道口處，整個(gè)切除雌性生殖道，(圖2-E至2-H)。一并取下膀胱，但不包括結腸，然后放置在紙上。

圖2  生殖道解剖，雄鼠(A-D)，雌鼠(E-H)。

（b:膀胱；c:結腸；e:附睪；o:卵巢；sv:精囊；t:睪丸；u:子宮角。）

剝去顱骨處的皮膚，并在眶間切開(kāi)顱骨(圖1-M)，以允許固定劑能夠滲透進(jìn)大腦。雙眼應連同視神經(jīng)一起切除并放入Hartmann’s固定液中。

剝離從肩部到尾根部的皮膚，去除皮下組織，鋪平放在紙上(圖1-N)。

從一側后肢沿股骨切取股四頭肌(圖1-O)。通過(guò)分割股二頭肌暴露坐骨神經(jīng)，取出并放在紙上(圖1-P)。

√注意：盡量減少對坐骨神經(jīng)的操作，因為它很容易損傷。

髖關(guān)節處取下剩余的后肢和后爪。這個(gè)樣本包含膝關(guān)節，可以脫鈣進(jìn)行組織學(xué)檢查。

從寰枕間隙開(kāi)始，切除兩側椎弓，并切除和收縮背突，使脊髓暴露至腰椎區域(圖1-Q和1-R)。胴體放置在10%的NBF中(圖1-S)，并固定至少24小時(shí)。

√提示：脊髓暴露是操作中最具技術(shù)挑戰性的部分。我們建議使用彎曲的和/或直的彈簧剪刀和胴體定位(平放在解剖臺上或彎曲在手上)，以減少對組織的張力。

總結

這種快速完整的小鼠尸檢方法可以保存小鼠的所有組織，并最大限度地從單個(gè)標本中獲得數據。雖然必須考慮到物種之間的差異，但這種方法很容易在大鼠、倉鼠、兔子等物種上復制。

不同的固定劑也可以用于滿(mǎn)足特定的研究需要。組織可以保存在福爾馬林中，或者在最短的固定時(shí)間后，可以修剪、加工、石蠟包埋、切片并染色進(jìn)行組織學(xué)分析。

注意，任何骨樣本在包埋前都必須脫鈣，以使其更容易切割和避免破碎。

參考資料：

1.A guide to post-mortem examination procedure in mouse models，Alexandra Rodrigues1, Lynn Beresford1, Cheryl L Scudamore etc，Laboratory Animals 2022, Vol. 56(5) 466–470