如前文《實(shí)驗動(dòng)物的常規眼科檢查》一文中所寫(xiě)，眼科檢查的操作流程可因動(dòng)物種屬和特點(diǎn)的研究目的而異。如果目的是篩查藥物等物質(zhì)對眼部組織的不良影響，則應至少進(jìn)行間接檢眼鏡和裂隙燈顯微鏡的檢查。根據檢查目的，也可執行其它程序，比如角膜染色、角膜知覺(jué)檢查、角膜厚度測量、眼壓計、眼底照相、熒光血管造影、光學(xué)相干斷層掃描 (OCT, Optical Coherence Tomography) 和視覺(jué)系統的電生理評估（例如視網(wǎng)膜電圖、多焦視網(wǎng)膜電圖、視覺(jué)誘發(fā)電位）。

許多無(wú)創(chuàng )性眼科診斷技術(shù)，可同時(shí)提供眼前節與眼后節的結構和功能信息。下面討論了其中一些技術(shù)，對這些技術(shù)適用于毒理學(xué)、眼科研究和臨床應用的場(chǎng)景進(jìn)行了初步討論。

01、眼壓測量

眼壓計用于獲得眼內壓 (IOP, Intraocular Pressure) 的間接測量值。市面上有幾種不同的商品化的手持式設備，其便攜性足以供眼科檢查人員使用，如壓陷、壓平或回彈式眼壓計。對于合同研發(fā)組織（CROs, Contract research organizations）使用的多種動(dòng)物種屬，通常認為Schiotz壓陷式眼壓計的結果不準確、不可靠，因此不應用于眼部毒理學(xué)研究。由于許多眼壓計最初設計用于人的角膜，用于動(dòng)物的讀數可能略不準確，但如果在整個(gè)研究期間由同一名檢查者使用相同的眼壓計，則研究中發(fā)生的眼壓變化將是有效的。

大多數實(shí)驗動(dòng)物的 IOP 范圍為 12-25 mmHg，雙眼之間的差異應≤5 mmHg。IOP 可受到多個(gè)變量的影響，如：保定技術(shù)、動(dòng)物應激、晝夜節律眼位、鎮靜或麻醉、角膜厚度等。如果可能，在進(jìn)行眼壓測量時(shí)，應在整個(gè)研究期間保持如下細節的統一：每天相同的測量時(shí)間、相同的眼壓計和操作技術(shù)、同一組檢查人員和保定人員，來(lái)測量試驗內所有動(dòng)物的 IOP。應在散瞳之前測定眼壓。當眼壓測量是研究的關(guān)鍵點(diǎn)時(shí)，建議研究開(kāi)始前先對動(dòng)物進(jìn)行保定適應和操作適應。

最常使用的是壓平式眼壓計，如Tono-Pen XL?、Tono-Pen Vet?、Tono-Pen AVIA? ，或非接觸式眼壓計。眼壓測量需表面麻醉時(shí)，0.5% 丙美卡因是最常見(jiàn)的選擇。該技術(shù)測量壓平角膜給定區域所需的力，然后將該施加力轉換為眼壓值（單位：mmHg）。一些壓平式眼壓計具有自我校準的優(yōu)勢（圖1），而非接觸式眼壓計可提供紙質(zhì)副本用于記錄保存，兩者都是藥物非臨床研究質(zhì)量管理規范（GLP，Good Laboratory Practice）類(lèi)研究的理想技術(shù)。Tono-Pen XL 和 Tono-Pen Vet? 產(chǎn)生4個(gè)獨立讀數，可對讀數取平均值，并顯示IOP和誤差百分比，即單個(gè)讀數之間變異性。Tono-Pen AVIA? 產(chǎn)生10 個(gè)獨立讀數，并以置信度百分比報告 IOP 和變異性。對于 Tono-Pen XL?，誤差百分比應 <5%，而對于 Tono-Pen AVIA?，置信度百分比應 >95%。

圖1  Tono-Pen AVIA Vet? 用于測量Dutch Belted Rabbit的眼壓

回彈式眼壓計通過(guò)向角膜發(fā)射一個(gè)小的塑料探針頭來(lái)確定眼壓，然后探頭反彈回設備中，產(chǎn)生感應電流，由此計算眼壓值。為了準確測量，探針必須以水平位置在角膜上擊發(fā)，即探針與地板平行。實(shí)驗動(dòng)物最常用的回彈眼壓計是 Tonovet?（圖2a）。Tonovet? 專(zhuān)門(mén)針對犬、貓和馬進(jìn)行了校準，但也已在其它種屬中可靠地使用。TonoLab 眼壓計是專(zhuān)門(mén)為小鼠和大鼠設計和校準的（圖2b）。在許多實(shí)驗動(dòng)物中，包括犬、兔和大鼠，Tonovet 和 TonoLab 眼壓計具有不需要局部麻醉的優(yōu)點(diǎn)，并且比 Tono-Pen? 更容易獲得 IOP，其缺點(diǎn)是在使用前不能自行校準。與 Tono-Pen? 和 Tonovet? 一樣，它也取6 個(gè)讀數的平均值，并使用眼壓值的左側欄指示誤差百分比。測量時(shí)，應沒(méi)有錯誤欄，或者欄應該位于屏幕的左下角，以使讀數可以接受。

無(wú)論使用何種眼壓計，通常每只眼應獲得并記錄至少 2-3 個(gè)最終平均讀數。由于除非接觸式外的所有眼壓計僅給出數字讀數，設備不會(huì )創(chuàng )建永久性記錄，因此必須手動(dòng)記錄 IOP 或將其輸入計算機數據庫中。

圖2  (a) The Tonovet? 回彈式眼壓計測量New Zealand white rabbit眼壓  (b) TonoLab 眼壓計小小的尖端可用于嚙齒類(lèi)的眼壓測定

02、角膜厚度測量法

角膜厚度測量法是一種無(wú)創(chuàng )性評價(jià)角膜厚度的方法。 最常使用專(zhuān)門(mén)為此目的設計的接觸式超聲設備（例如 PachPen?）進(jìn)行（圖3），但也可以通過(guò)高分辨率超聲檢查或光學(xué)相干斷層掃描（OCT, Optical Coherence Tomography）獲得角膜厚度的測量結果。在角膜水腫可被生物顯微鏡檢測出之前，角膜厚度測量法可對角膜厚度的細微變化進(jìn)行評價(jià)。角膜厚度可因種屬的不同，以及角膜區域不同（軸向或周邊）而變化。由于區域差異，必須在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)從角膜的相同區域進(jìn)行測量，通常選用軸向。

圖3  PachPen 測量New Zealand white rabbit角膜厚度

03、熒光素染色法

在涉及眼局部給藥、角膜接觸鏡評價(jià)的研究，和使用改良 Hackett-McDonald 評分系統的其他研究中，通常使用熒光素鈉溶液評價(jià)角膜上皮的完整性。熒光素是一種水溶性熒光染料，可被親水性角膜基質(zhì)保留，但不被角膜上皮保留。它可用于輔助識別角膜上皮缺損，也可用于評價(jià)角膜前的淚膜滯留。熒光素以單個(gè)浸漬條帶的形式提供，使用時(shí)使用無(wú)菌生理鹽水潤濕。將濕潤的條帶輕輕涂抹在背側球結膜上，注意不要接觸角膜。然后使用鹽水輕輕沖洗多余的熒光素。或者，可將熒光素條置于塑料注射器中，并加入預定體積的無(wú)菌生理鹽水，以產(chǎn)生已知熒光素濃度的溶液，然后滴在角膜上。由眼科檢查人員使用帶有鈷藍濾光片的生物顯微鏡對角膜進(jìn)行檢查，觀(guān)察是否有殘留的熒光。

04、眼部照相

眼部照相可用來(lái)證明眼底等區域無(wú)變化，或記錄異常以及監測病變的進(jìn)展。可在研究期間的不同時(shí)間點(diǎn)拍攝照片來(lái)進(jìn)行比較，以準確地確定異常是靜態(tài)的還是進(jìn)行性的。由于照相增加了額外的時(shí)間、成本和動(dòng)物應激，因此并非所有研究均需進(jìn)行。在觀(guān)察到病變時(shí)，或很可能引起眼部異常的研究中（例如眼內植入物，玻璃體內或視網(wǎng)膜下注射研究），可在研究方案中將其作為一種記錄病變的選擇。

眼部照相可分為眼外部和眼內部。眼外部的拍攝可使用帶有微距透鏡的標準單鏡頭反光（SLR, Single Lens Reflex）數碼相機，或帶屈光度設置調節以允許眼外部和眼前節成像的數字 Kowa Genesis-D 眼底照相機。眼后節的拍攝需要特定類(lèi)型的眼底照相機，數字化Kowa Genesis-D 照相機、RetCam、Phoenix Micron IV 和 Micron X 適用于大多數實(shí)驗動(dòng)物的拍攝（圖4）。這些照相機可適用于間接眼部照相、嚙齒類(lèi)動(dòng)物眼底照相和熒光血管造影。眼底照相的優(yōu)點(diǎn)是能夠永久保存記錄，以比較潛在的研究相關(guān)結果，如果有發(fā)現，則可由另一名眼科檢查再次進(jìn)行獨立審閱。

在拍攝照片時(shí)，所有照片都應使用相同的放大倍率和照明設置。此外，所有動(dòng)物均應按相同眼別順序（左和右）進(jìn)行拍攝，同時(shí)應保存動(dòng)物標識和設備日志等拍攝記錄。上述標準也可作為標準操作規程 (SOP, Standard Operating Procedures) 的一部分。

圖4  可用于實(shí)驗動(dòng)物的眼底相機

05、熒光血管造影

熒光血管造影可用于評價(jià)眼內動(dòng)脈和靜脈的血管完整性。雖然其最常用于檢查視網(wǎng)膜和脈絡(luò )膜的血管，但也可用于檢查虹膜血管。在毒理學(xué)研究中最常用于評價(jià)供試品對于新生血管形成的影響。目前，它已被應用于多種實(shí)驗動(dòng)物，最常選用的是10%熒光素鈉，也有部分研究選擇吲哚菁綠。

熒光血管造影技術(shù)需要散瞳，并進(jìn)行鎮靜或麻醉。將光可激發(fā)的化合物熒光素靜脈注射，可獲得目標組織（脈絡(luò )膜視網(wǎng)膜和虹膜）的一系列定時(shí)圖像。與熒光素注射相關(guān)的并發(fā)癥可能包括滲漏后組織刺激、嘔吐和過(guò)敏反應。必須在能夠拍攝多幅、快速排序圖像的眼底照相機上使用激發(fā)濾光片 (490 nm) 和屏障濾光片 (520-520 nm)。Kowa Genesis-Df、RetCam Shuttle、Phoenix Micron X 和 Heidelberg Spectralis cSLO 可用于熒光血管造影，且是便攜式的（圖4）。在注射熒光素前，先拍攝對照的彩色圖像，然后每 20s 拍攝一組，獲得連續圖像。由于熒光素填充脈絡(luò )膜視網(wǎng)膜血管，因此描述了血管流動(dòng)的各個(gè)階段。它們包括動(dòng)脈前期、動(dòng)脈期、動(dòng)靜脈期、靜脈期及后期。熒光血管造影觀(guān)察到的異常可能包括血管異常（動(dòng)脈瘤、新生血管形成）、熒光受阻、熒光素滲漏、低熒光和高熒光。

06、視網(wǎng)膜電圖/視覺(jué)誘發(fā)電位

根據毒理學(xué)研究目的，以及可能受影響的視覺(jué)系統的特定方面，有多種電生理學(xué)試驗可用于評價(jià)視網(wǎng)膜和視覺(jué)通路。視網(wǎng)膜電圖 (ERG, Electroretinography) 是測量視網(wǎng)膜在受到光刺激時(shí)產(chǎn)生的電勢。標準 ERG 是一種全視野刺激，可提供關(guān)于整個(gè)視網(wǎng)膜的信息，是視網(wǎng)膜色素上皮、光感受器和內層視網(wǎng)膜的群體反應。對于局部視網(wǎng)膜評價(jià)可選用多焦視網(wǎng)膜電圖 (mfERG, multifocal electroretinogram)。對于黃斑區神經(jīng)節細胞的評價(jià)可選用圖形倒轉視網(wǎng)膜電圖 (PERG, pattern reversal electroretinogram)。而為了評價(jià)從視網(wǎng)膜到視覺(jué)皮層的整個(gè)視覺(jué)通路，視覺(jué)誘發(fā)電位 (VEP, visual evoked potential) 則是首選技術(shù)。在這些試驗中，全視野 ERG最常用于臨床前毒理學(xué)試驗。ERG 提供了一種非侵入性的可重復評估視網(wǎng)膜功能的方法，它可結合間接檢眼鏡和組織病理學(xué)來(lái)對視網(wǎng)膜結構和功能進(jìn)行綜合評估。

ERG應在散瞳后按標準流程進(jìn)行，目前人和犬的ERG有許多可參考的國際指南，可作為試驗設計的參考。在獲得全視野ERG過(guò)程中，如下條件建議保持一致：房間照明情況、暗適應、閃光強度、頻率以及使用的鎮靜或麻醉劑劑量。

07、光學(xué)相干斷層掃描

光學(xué)相干斷層掃描是一種高分辨率的無(wú)創(chuàng )成像技術(shù)，可提供眼部結構的實(shí)時(shí)橫斷面圖像，最常用于視網(wǎng)膜和視神經(jīng)，其軸向分辨率為 2-10 μm，也可用于眼前節的成像。與許多先進(jìn)的成像技術(shù)一樣，它需要鎮靜或麻醉、散瞳和專(zhuān)門(mén)的設備。當進(jìn)行 OCT 成像時(shí)，可看到所有的單個(gè)視網(wǎng)膜層，并測量其厚度，以便隨時(shí)間進(jìn)行定量和多次重復評價(jià)。其可測量視盤(pán)的杯面積、盤(pán)面積、杯直徑、盤(pán)直徑以及邊緣面積。通過(guò) OCT 對前節進(jìn)行檢查則可了解角膜、前房、虹膜和虹膜角膜角的結構信息，且其無(wú)需像超聲生物顯微鏡 (UBM, ultrasound biomicroscopy) 所需的那樣接觸角膜。它還提供了比 UBM更高的軸向分辨率。OCT 在實(shí)驗動(dòng)物中已應用于多個(gè)種屬，其在人類(lèi)疾病動(dòng)物模型和臨床前試驗中的應用也將越來(lái)越多。

隨著(zhù)技術(shù)的進(jìn)步，頻域 OCT (SD-OCT, spectral-domain OCT) 使用非機械技術(shù)，比傳統 OCT 或時(shí)域 OCT (TD-OCT, time-domain OCT) 明顯更快。SD-OCT 同時(shí)測量一個(gè)光譜中多個(gè)波長(cháng)的反射光，因此被稱(chēng)為光譜域。SD-OCT 比 TD-OCT 快 100 倍，每秒可采集 70,000 + 次 A-scan，其掃描速度和次數的增加可轉化為更高分辨率。

08、角膜內皮顯微鏡檢查

角膜內皮顯微鏡可對角膜內皮細胞進(jìn)行活體非侵入性的成像觀(guān)察，可采用接觸或非接觸方法進(jìn)行。一旦可視化，可評價(jià)角膜內皮細胞的細胞形態(tài)，并可定量為每 mm 的細胞數量 。正常角膜內皮細胞排列規則，呈六角形。內皮顯微鏡可評價(jià)細胞的密度、多形性和變異情況。由于細胞數量可因動(dòng)物年齡和角膜區域的不同而變化，因此須使用相同年齡的動(dòng)物對這些變量進(jìn)行標準化，并檢查軸向角膜。須對動(dòng)物進(jìn)行鎮靜或麻醉，以獲得準確的圖像，并可適用于簡(jiǎn)化技術(shù)的自動(dòng)化系統。FDA 已經(jīng)設立了關(guān)于臨床試驗中角膜內皮顯微鏡檢查的指南，這些指南可以作為臨床前研究設計的起點(diǎn)。除角膜內皮顯微鏡外，還可選用體內高分辨率共聚焦顯微鏡 (Heidelberg Retina Tomograph with Rostock Corneal Module) 進(jìn)行角膜內皮成像和分析（圖5）。

圖5  Heidelberg Retina Tomograph (with Rostock Corneal Module)用于角膜內皮的成像和分析

小結

在本篇文章中，我們總結了在醫藥行業(yè)等研究場(chǎng)景中的非常規眼科檢查的適當方法和技術(shù)。這些技術(shù)將在眼部毒理學(xué)領(lǐng)域中越來(lái)越普遍，技術(shù)人員可在研究過(guò)程中根據試驗的設計和已發(fā)現的眼科學(xué)變化等關(guān)鍵因素，來(lái)選用進(jìn)一步的檢查辦法。

參考文獻

[1] Gilger B C, Cook C S, Brown M H. Standards for Ocular Toxicology and Inflammation [M].  2018.