長(cháng)期以來(lái)哨兵鼠方案在實(shí)驗嚙齒類(lèi)動(dòng)物的微生物質(zhì)量監測中都扮演著(zhù)重要角色，我國《實(shí)驗動(dòng)物微生物、寄生蟲(chóng)學(xué)等級及監測》（GB 14922-2022）也增加了可以“按要求選取哨兵動(dòng)物”檢測的描述。本文將就哨兵鼠方案展開(kāi)討論，與讀者朋友們一起探討如何設置哨兵鼠，不同設置方案的優(yōu)缺點(diǎn)有哪些，并在此基礎上與讀者朋友們探討如何制定適合自己設施的哨兵鼠監測方案。

哨兵鼠是用于監控實(shí)驗大小鼠飼養環(huán)境中病原及病原感染的動(dòng)物，一般與被監測動(dòng)物遺傳學(xué)背景相同，且微生物背景清晰。當被檢測動(dòng)物群體因數量龐大導致抽樣檢測成本過(guò)高；或被檢測動(dòng)物較為珍貴，不能輕易犧牲；又或被監測動(dòng)物本身是免疫缺陷動(dòng)物或者進(jìn)行過(guò)基因改造免疫功能異常的情況下，不適宜直接抽檢，在這些情況下，都需要使用哨兵鼠方案解決設施內動(dòng)物微生物質(zhì)量監控的問(wèn)題。按照哨兵鼠與被監測動(dòng)物的接觸方式可分為直接接觸哨兵鼠和臟墊料哨兵鼠，近年來(lái)國外一些機構還創(chuàng )新性使用了“廢氣哨兵鼠”。

直接接觸哨兵鼠

直接接觸哨兵鼠是將哨兵鼠和被監測動(dòng)物放在同一個(gè)鼠籠內共同飼養至少4周, 通過(guò)直接接觸促進(jìn)微生物或寄生蟲(chóng)的暴露和傳播，因此，該方案可以檢測各種不同傳播途徑的微生物和寄生蟲(chóng)感染，包括直接接觸，氣溶膠，尿液和糞口途徑，這也是該方案最大的優(yōu)點(diǎn)。但這個(gè)方案最大的缺點(diǎn)是必須在每個(gè)籠子里放置哨兵動(dòng)物，導致其只能在被監測動(dòng)物數量很少的情況下才能使用，否則其監測成本將非常高昂，也正是因為這個(gè)原因，直接接觸哨兵鼠的使用非常少。

臟墊料哨兵鼠

臟墊料哨兵鼠是以間接接觸和延遲反饋的方式監測鼠群的微生物攜帶狀況。可以使用相對較少的動(dòng)物來(lái)監測更多籠動(dòng)物，通常一到兩籠哨兵鼠可以監測50-80籠動(dòng)物，大大降低了監測成本，在監測成本和監測效果之間達成了良好的平衡，故而是長(cháng)期以來(lái)最普遍采用的監測方案。盡管現在歐美許多設施正在用更新的排氣口粉塵樣本監測方案補充和替代它，但目前階段，我國更多設施依然單獨（主要）采用該方案。

通常而言，每面單獨通風(fēng)籠（IVC或EVC）的籠架可以設置1-2籠哨兵鼠籠，位置通常選擇在最后一個(gè)回風(fēng)位，每籠一般放2-3只哨兵鼠，每次換籠時(shí)將每籠被監測動(dòng)物的臟墊料（含糞便）取30-50g到哨兵鼠籠中，哨兵鼠籠中使用50%-100%的臟墊料，以確保有足夠多的微生物和哨兵動(dòng)物接觸。如果所有被監測籠的臟墊料加在一起量太多，可以減少新鮮墊料的比例，如果還是太多，則可以充分混勻所有臟墊料后再取出一部分。

在被監測動(dòng)物中，感染自限性病毒(如小鼠輪狀病毒、小鼠肝炎病毒、小鼠肺炎病毒等)的免疫健全動(dòng)物的病毒脫落量會(huì )隨著(zhù)時(shí)間推移而減少，直到最終大多數感染被宿主免疫系統清除。因此為了最大限度地提高檢出率，應該盡量減少臟墊料的稀釋?zhuān)诒\可全部使用臟墊料而不加入干凈墊料。但即便是如此，在單獨通風(fēng)籠具廣泛使用的今天，仍有可能會(huì )出現某種病原體在非常有限的籠盒內低密度流行的情況，這時(shí)，轉入哨兵籠中的臟墊料所攜帶的有傳染性的病原體的量可能不足以感染哨兵動(dòng)物，由此就會(huì )造成一定程度的漏檢。

臟墊料哨兵鼠能有效監測通過(guò)糞-口途徑傳播的病原體，如小鼠肝炎病毒、呼腸孤病毒等，但對于主要通過(guò)氣溶膠、直接接觸等途徑傳播的病原體，其監測效果就不盡如人意了，例如：仙臺病毒、嗜肺巴斯德桿菌、肺支原體等。

為了讓可能存在的病原體有足夠的時(shí)間定植和傳播，應將哨兵暴露在臟墊料中至少四周。由于這種滯后性，對于那些新購入需要盡快完成檢疫進(jìn)入設施的動(dòng)物、需要快速反饋微生物結果的動(dòng)物等，臟墊料哨兵鼠的滯后性無(wú)法滿(mǎn)足其需要。

廢氣哨兵方案

隨著(zhù)更多的單獨通風(fēng)籠具系統的使用，利用排風(fēng)口粉塵來(lái)監測動(dòng)物微生物質(zhì)量的方案正變得越來(lái)越流行。這種方案也有兩個(gè)形式：

第一種是從單獨通風(fēng)籠具的所有籠盒排出的廢氣被輸送到裝有哨兵動(dòng)物的籠子，這直接使哨兵動(dòng)物暴露在廢氣中，同樣的，暴露于廢氣的動(dòng)物至少要暴露一個(gè)月，以確保哨兵動(dòng)物感染可能存在的微生物（見(jiàn)圖1），這種方法使得通過(guò)氣溶膠傳播的病原體能成功感染哨兵鼠，可以改善監測效果，不過(guò)可能是由于需要額外使用特殊的哨兵籠通風(fēng)裝置，該方法的應用并不廣泛。

圖1:廢氣哨兵鼠籠空氣流向[1]

（引自BioZone, Inc.）

第二種是使排出的空氣流過(guò)裝有粉塵收集介質(zhì)，直接用PCR方法檢測該介質(zhì)，也就是我們常說(shuō)的通風(fēng)口粉塵（Exhaust Air Dust，EAD）檢測。目前這種方法被更廣泛地應用于歐美許多設施的實(shí)驗動(dòng)物微生物監測。與臟墊料哨兵鼠方案相比，EAD方案的時(shí)效性和檢出率都有了顯著(zhù)提升，最快暴露后一周就可檢出，且在感染比率非常低（1/63）的情況下就可以成功檢測到感染因子。目前國外的籠具品牌Tecniplast、Allentown以及我國籠具品牌新華醫療等都推出了專(zhuān)門(mén)針對自己的籠具系統所設計的通風(fēng)口粉塵收集器，盡管它們不是真正的哨兵“鼠”，但承擔著(zhù)同樣的角色。

不過(guò)，這種方法也并非完美，在使用前，有幾個(gè)問(wèn)題需要了解：

（1）籠盒、籠架設計和EAD監測方案的有效性密切相關(guān)，如果從籠盒中排出的空氣經(jīng)過(guò)過(guò)濾后再排到主管道，那采集的出風(fēng)口粉塵是無(wú)法檢測到病原體核酸的。

（2）如果設施中曾經(jīng)發(fā)生過(guò)微生物污染，且籠架通風(fēng)管道清洗中未清除干凈所有核酸片段，那就可能造成假陽(yáng)性結果。

（3）為保證檢測結果的可靠性，通常建議將樣本外送到專(zhuān)業(yè)的檢測機構進(jìn)行分析。而這可能會(huì )使得直接檢測成本較臟墊料哨兵鼠方案更高。

從以上的介紹可以看出，每種方案都有自己的可取之處，也同時(shí)有難以避免的缺點(diǎn)，因此在制定監測方案時(shí)，許多設施會(huì )同時(shí)使用多個(gè)方法，以確保最佳的檢測結果。

哨兵鼠的選擇標準

除過(guò)濾介質(zhì)排風(fēng)系統外，所有嚙齒動(dòng)物健康監測項目都需要使用活體嚙齒動(dòng)物。以下是選擇哨兵動(dòng)物時(shí)需要考慮的標準:

來(lái)源：哨兵動(dòng)物應來(lái)自經(jīng)批準的、信譽(yù)良好的供應商或能夠提供完善質(zhì)量檢測證據的設施。用作哨兵鼠的動(dòng)物不應攜帶所需監測的所有病原體。

品系：選作哨兵鼠的動(dòng)物品系至關(guān)重要，常用的品系有ICR小鼠、SD大鼠等。通常要遵循的原則有：對所監測的病原體易感、與被監測動(dòng)物的（背景）品系一致、易于發(fā)生血清轉化、價(jià)格相對低廉。有些品系的動(dòng)物對特定病原體的易感性低，應該避免選作哨兵鼠，例如SJL小鼠對呼吸株MHV病毒不易感、C57BL/6對MPV有抗性，還有DBA/2會(huì )存在抗體轉化延遲，也不適宜作為哨兵鼠。

有少數設施會(huì )選擇免疫缺陷小鼠（例如裸鼠或有毛雜合子）作為哨兵鼠，其感染病原體后表現為持續感染，可提高檢出率；而裸鼠在監測牛棒狀桿菌等免疫健全小鼠不易感的病原體方面會(huì )有更好表現。但是由于免疫缺陷動(dòng)物感染這些病原體后更容易造成更為嚴重的疾病，因此面臨動(dòng)物福利方面的挑戰。

性別：通常認為雌性比雄性更適合做哨兵，因為雄性動(dòng)物更容易打架，造成傷害，且雄性動(dòng)物可能會(huì )導致被監測動(dòng)物計劃外懷孕造成基因污染。如果要使用雄性動(dòng)物可以去勢后再使用。

年齡：通常選擇在4-6周齡(最大不超過(guò)10周齡)的動(dòng)物作為哨兵鼠。這是為了確保小鼠較好的免疫能力，且不會(huì )患上與年齡相關(guān)的疾病。

替換：一旦哨兵籠中有一個(gè)哨兵動(dòng)物被取出，應該在1-2周內補充。這將最大限度地增加病原體暴露的可能性，并使新動(dòng)物在下一輪檢測之前完成抗體轉化。

哨兵鼠采樣

通常，哨兵鼠至少要與被監測動(dòng)物或其臟墊料、廢氣接觸至少4周才可用于檢測，這是因為免疫系統需要1-2周才能完成血清轉化，部分病原體，例如小鼠諾如病毒則需要長(cháng)達8周的時(shí)間才能完成血清轉化。同時(shí)，細菌和寄生蟲(chóng)也需要一定時(shí)間定植和增殖到可檢出水平。

檢測頻率通常建議是每季度檢測一次，但是對于那些動(dòng)物種類(lèi)多、數量大、人員進(jìn)出頻繁、操作頻繁的設施，以少量多次的形式可以更好提高檢出效率，例如，每月檢測一次。而對于那些長(cháng)期都沒(méi)有檢出的病原體，也可參考FELASA推薦的做法，降低檢出頻率，例如，每半年或一年檢測一次。

關(guān)于哨兵鼠的設置，讀者朋友們還期望關(guān)注那些內容或者有哪些經(jīng)驗分享，歡迎在本號留言。

References：

1.Compton SR, Homberger FR, MacArthur-Clark,J. Microbiological monitoring in individually ventilated cage systems. Lab Anim (NY) ，2004，33:36-41.

2.https://www.taconic.com/taconic-insights/quality/rodent-sentinels.html

3.https://www.jax.org/news-and-insights/2005/may/using-sentinels-in-mouse-rooms

4.https://www.criver.com/resources/info-pi-rm-guidebook-strategies-infection-surveillance

5.趙勇, 范春, 朱閩娟,等. 屏障環(huán)境的哨兵動(dòng)物應用[J]. 實(shí)驗動(dòng)物與比較醫學(xué), 2020, 40(1):4.