嚙齒類(lèi)實(shí)驗動(dòng)物是使用最多的實(shí)驗動(dòng)物，其微生物質(zhì)量控制一直是實(shí)驗動(dòng)物設施管理者的工作重點(diǎn)。每個(gè)設施都有自己的動(dòng)物健康監測方案，其中哨兵鼠（Soiled Bedding Sentinels, SBS）長(cháng)期以來(lái)應用最為廣泛。但由于哨兵鼠方案本身存在的一些缺點(diǎn)，常常無(wú)法及時(shí)有效地監測微生物污染的發(fā)生，且需要額外使用動(dòng)物，并不符合3R原則（詳見(jiàn)本號前期文章：哨兵鼠設置，你想知道的都在）。

近幾年，國際上有越來(lái)越多的設施將環(huán)境樣本PCR檢測（Environmental Health Monitoring, EHM）作為哨兵鼠方案的補充或替代方案，以便更及時(shí)靈敏地監測動(dòng)物（條件）致病微生物感染和攜帶狀況。我國也有少數設施采取這種監測方案。該方案不僅提高了檢測的敏感性，還減少了動(dòng)物使用數量，同時(shí)在哨兵鼠設置和飼養上的時(shí)間和金錢(qián)成本也得到了節省。隨著(zhù)該方法的不斷優(yōu)化和普及，哨兵鼠方案在歐美多國有逐漸被取代的趨勢。本文就簡(jiǎn)要介紹一下EHM方案。

1、EHM方案的采樣方式

EHM方案最早采用無(wú)菌拭子擦拭附著(zhù)在出風(fēng)口的粉塵（Exhaust Air Dust，EAD），或用特定大小的紗布或濾紙固定在出風(fēng)口初效過(guò)濾器上收集粉塵。后來(lái)泰尼百斯、Allentown等籠具公司設計了專(zhuān)門(mén)的采樣口/卡槽并配套使用采樣卡，使得樣本采集更加簡(jiǎn)便，并標準化。這兩種方法都需要廢氣排出時(shí)不能在籠盒水平進(jìn)行空氣過(guò)濾。目前在美國、加拿大等國家這兩種方法都是被普遍使用的采樣方式。

近幾年，將植絨拭子、濾紙等介質(zhì)放入臟墊料盒中代替哨兵鼠，通過(guò)充分接觸可能存在的病原微生物進(jìn)行采樣的方法也被逐步采用。該方法不僅適用于所有設計形式的籠具，同時(shí)還可有效避免由于籠架清洗不充分所殘留的核酸引起的假陽(yáng)性結果。

不論是使用哪種采樣方式，獲取的樣本都是用PCR方法檢測目標病原體核酸，而由于PCR方法的高敏感性，因此足以檢測到樣本中的微量核酸。

Jensen, JAALAS, 2013

Miller, JAALAS, 2016

Mahabir, Lab Anim., 2018

Pettan-Brewer，JAALAS, 2020

Varela，JAALAS, 2022

2、檢測結果的準確性

在綜合分析了已公開(kāi)發(fā)表的33篇文獻后發(fā)現，臟墊料哨兵鼠方案對各種病原體的總檢出率約76%，而EHM的檢出率約96%。（詳見(jiàn)表1）

目前小鼠肝炎病毒、小鼠細小病毒、仙臺病毒、嗜肺巴斯德桿菌、螺桿菌、鞭毛蟲(chóng)、蟯蟲(chóng)及螨蟲(chóng)等多種病原體都已證實(shí)可在EAD樣本中準確檢出。特別是其中有些病原體在臟墊料哨兵鼠方案會(huì )漏檢，但卻可以成功通過(guò)EHM檢測到，例如仙臺病毒、嗜肺巴斯德桿菌、螺桿菌、鼠阿米巴、蟯蟲(chóng)等。但是也有一些病原體，尚未證實(shí)可以檢出，或不同研究顯示其檢測效果尚有爭議，例如輪狀病毒、鏈球菌等。

表1：不同病原體在臟墊料哨兵鼠和環(huán)境樣本中的檢出情況

*：檢出某病原體的文章數量/評估某病原體的文章數量

3、歐美實(shí)驗動(dòng)物設施EHM使用情況

一項覆蓋美國、加拿大、歐洲、英國等多個(gè)國家和地區的111個(gè)動(dòng)物設施的調查報告顯示，在大小鼠的月度和季度常規健康監測中，有11%的設施單獨使用EHM，41%的設施單獨使用臟墊料哨兵鼠，46%的設施使用多種方案組合，此外有2%的設施不進(jìn)行常規健康監測。

對于檢疫期嚙齒類(lèi)動(dòng)物，由于有更高的時(shí)效性要求，有更多人會(huì )選擇EHM方案，在被調查的111個(gè)設施中，63%的機構單獨使用EHM，15%的設施單獨使用臟墊料哨兵鼠方案，14%的設施使用多種方法組合，還有8%的設施不檢測檢疫期動(dòng)物。

由以上數據可以看出，目前在檢疫檢測中，由于EHM可以更快反饋結果，因而使用更廣泛，但在常規健康監測中用EHM將臟墊料哨兵鼠完全替代的還是少數。但業(yè)內人士普遍相信，隨著(zhù)越來(lái)越多的數據支持、廣泛的宣傳和專(zhuān)業(yè)指導，使用EHM方案的設施數量會(huì )越來(lái)越多。

4、實(shí)施EHM監測前應該評估的內容

籠架和籠盒構造可能是在實(shí)施EHM方案前最需要考慮的因素。如何采樣、采樣位置選擇將直接影響監測效果，因此建議對于不同類(lèi)型、不同廠(chǎng)家的籠具都應該充分驗證采樣時(shí)間、方式和位置后再正式使用。

如果設施中曾經(jīng)發(fā)生過(guò)某種微生物污染，或所使用的墊飼料中殘留某種微生物的核酸，那籠架出風(fēng)口粉塵樣本中就很可能存在其核酸片段，這就會(huì )造成假陽(yáng)性結果。例如，某設施在做驗證時(shí)發(fā)現在用出風(fēng)口粉塵樣本檢測時(shí)可以檢測到大量綠膿桿菌核酸，但最終證實(shí)動(dòng)物并沒(méi)有感染，環(huán)境中也沒(méi)有活菌，而是所使用的飼料中存在綠膿桿菌核酸，這種混淆會(huì )耗費大量精力和成本。

對于多數設施來(lái)說(shuō)，使用哨兵鼠方案則可以通過(guò)購買(mǎi)商業(yè)化試劑進(jìn)行自檢，但如果使用EHM方案，則需要進(jìn)行PCR自檢，那很可能由于方法驗證不充分、實(shí)驗室條件不適宜、氣溶膠污染等多種因素造成實(shí)驗結果的不可靠。如果將EHM樣本送檢專(zhuān)業(yè)第三方檢測機構，檢測成本則要明顯高于哨兵鼠檢測。盡管在哨兵鼠購買(mǎi)、飼養、樣本采集等方面需要消耗更多資金和勞動(dòng)力成本，甚至經(jīng)過(guò)折算這部分成本是高于支出的檢測費的，但相較于檢測費，這些成本更為“隱形”。

由于標準更新的周期漫長(cháng)，目前國標GB/T 14926中檢測病原微生物的主要方法是血清學(xué)方法、培養法和鏡檢法，而極少提及分子生物學(xué)方法，這也使得不同實(shí)驗室間方法不統一，使得其推廣應用及不同機構間互認的阻礙增加。

展望

總而言之，目前在美國、加拿大、歐洲等國家和地區，EHM的驗證和應用越來(lái)越廣泛，已經(jīng)有少數設施完全取消了臟墊料哨兵鼠的使用，每年可減少數萬(wàn)只哨兵動(dòng)物的使用。我國開(kāi)展驗證和應用EHM方案的機構數量還十分稀少，但是也逐漸有越來(lái)越多的設施管理者開(kāi)始關(guān)注并嘗試。所以短期內臟墊料哨兵鼠還是會(huì )被廣泛應用，但是隨著(zhù)管理人員對結果時(shí)效性、敏感性的要求的提高和方法的充分驗證，EHM一定會(huì )被更多使用，并逐步替代哨兵鼠方案。

參考文獻：

1. Luchins KR, Gates KV, Winn CB, Manuel CA, Pettan-Brewer C, Foley PL, Peterson NC, Garner JP, Hanson W, LaFollette MR. A Cross-sectional Survey on Rodent Environmental Health Monitoring Practices: Benchmarking, Associations, and Barriers. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2023 Jan 1;62(1):64-73. doi: 10.30802/AALAS-JAALAS-22-000086. PMID: 36755202; PMCID: PMC9936849.

2. https://na3rc.sharepoint.com

3. Winn CB, Rogers RN, Keenan RA, Gerwin PM, Matthews KA, Ramirez JA, Bennett TE, Perkins CL, Henderson KS. Using Filter Media and Soiled Bedding in Disposable Individually Ventilated Cages as a Refinement to Specific Pathogen-free Mouse Health Monitoring Programs. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2022 Jul 1;61(4):361-369. doi: 10.30802/AALAS-JAALAS-22-000013. Epub 2022 Jun 24. PMID: 35750479; PMCID: PMC9674011.

4. Mailhiot D, Ostdiek AM, Luchins KR, Bowers CJ, Theriault BR, Langan GP. Comparing Mouse Health Monitoring Between Soiled-bedding Sentinel and Exhaust Air Dust Surveillance Programs. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2020 Jan 1;59(1):58-66. doi: 10.30802/AALAS-JAALAS-19-000061. Epub 2019 Dec 20. PMID: 31862019; PMCID: PMC6978580.

5. de Bruin WC, van de Ven EM, Hooijmans CR. Efficacy of Soiled Bedding Transfer for Transmission of Mouse and Rat Infections to Sentinels: A Systematic Review. PLoS One. 2016 Aug 12;11(8):e0158410. doi: 10.1371/journal.pone.0158410. PMID: 27518654; PMCID: PMC4982683.