最近驚聞一位朋友因患一種名為肝豆狀核變性的罕見(jiàn)病而離世，突感罕見(jiàn)病并不罕見(jiàn)，它往往就在我們身邊。因筆者對肝豆狀核變性研究有所涉獵，本文將對該病及其動(dòng)物模型作簡(jiǎn)要介紹。

01、首次發(fā)現及致病機制

肝豆狀核變性又名Wilson病(Wilson’s disease，WD) ，1912年首次由Samuel Kinnear Wilson博士描述。該病表現為“漸進(jìn)性豆狀核退化”，在患者的肝臟和大腦等器官中發(fā)現了過(guò)量的銅，該病在全球的患病率約為1/30000。經(jīng)過(guò)多年研究，肝豆狀核變性（WD）的發(fā)病機制已經(jīng)研究的較為清楚，它是一種常染色體隱性遺傳銅代謝障礙疾病[1]。1993年三個(gè)獨立研究小組幾乎同時(shí)發(fā)現了ATP7B基因為Wilson病的致病基因。該基因編碼銅轉運P型 ATP酶 ( copper-transporting P-type ATPase，ATP7B)[2]，WD患者攜帶發(fā)生突變的ATP7B基因，血清銅藍蛋白合成及正常的銅代謝過(guò)程發(fā)生障礙，過(guò)量的銅沉積在組織器官中，如肝臟、大腦、腎臟、角膜中，其中最常受累的是肝臟和神經(jīng)系統[3]。

圖1.ATP7B蛋白結構圖

圖注：N-端包含六個(gè)結合銅的金屬結合結構域（MBD1-MBD6，青色）；參與Cu配位的殘基在膜內的位置為CPC、YN和MXXXS；位于C末端的兩個(gè)亮氨酸基序（1459LL和1487LL）對胞吞作用和TGN從質(zhì)膜重新定位至關(guān)重要[4]。

02、臨床表現及診斷

WD患者在臨床表現上包括嚴重程度不等的肝損傷、持續性血清轉氨酶升高、急性或慢性肝炎、代償期或失代償期肝硬化和暴發(fā)性肝功能衰竭等[5]。神經(jīng)系統的表現以椎體外系病變癥狀為主，包括僵硬、震顫、運動(dòng)遲緩、構音障礙、吞咽障礙、舞蹈癥狀、癲癇發(fā)作等，精神癥狀包括躁狂、性格改變、抑郁等[6, 7]。此外腎臟、血液系統及骨關(guān)節等器官系統，也會(huì )出現相應的臨床癥狀和體征。

患者出現以下一些癥狀或指標可供臨床診斷：

1. 角膜K-F環(huán)是某些WD患者一個(gè)比較明顯的特征。K-F環(huán)為角膜邊緣的黃綠色或黃灰色色素環(huán)，一般在手電筒側光照射下肉眼可見(jiàn)，7歲以下患者一般無(wú)法檢出角膜K-F環(huán)。

2. 肝脾檢查：肝功能血清轉氨酶、膽紅素升高和（或）白蛋白降低；肝脾B超：常顯示肝實(shí)質(zhì)光點(diǎn)增粗、回聲增強甚至結節狀改變；部分患者脾臟腫大；肝臟MRI檢查常顯示肝脂質(zhì)沉積、不規則結節及肝葉萎縮等。

3. 采用銅代謝相關(guān)生化檢查，銅藍蛋白<120mg/L，24小時(shí)尿銅≥100μg。

4. 顱腦MRI檢查主要表現為殼核、尾狀核頭部、丘腦、中腦、腦橋及小腦T1低信號、T2高信號，少數情況下可出現T1高信號或T1、T2均低信號。

5. 基因篩查：對于臨床證據不足但又高度懷疑WD的患者，篩查ATP7B基因致病變異對診斷具有指導意義。

圖2. 角膜邊緣黃色渾濁的K-F環(huán)

03、ATP7B突變類(lèi)型及地理分布

ATP7B基因突變在不同種族和地域中存在遺傳異質(zhì)性。歐洲人群最常見(jiàn)的突變類(lèi)型是14號外顯子上的 H1069Q突變，在意大利、瑞典和羅馬尼亞等地多見(jiàn)，臨床主要以錐體外系癥狀為主，如震顫、肌張力障礙、精神癥狀等。亞洲人群最常見(jiàn)的突變類(lèi)型是 8號外顯子上的錯義突變R778L，以中國、韓國和日本最多見(jiàn)，臨床以肝臟方面癥狀為主，如肝功能異常、肝硬化、肝脾大等；其余常見(jiàn)的還有 P992L、Q1399R等[8]。

04、肝豆狀核變性動(dòng)物模型

1. “毒乳”( toxic milk，TX)小鼠

肝豆狀核變性動(dòng)物模型中最有名的是一種“毒乳”( toxic milk，TX)TX小鼠。 “毒乳”小鼠這一名稱(chēng)源自雌性純合子TX小鼠乳汁中缺乏銅，因此其哺乳的幼鼠在2周左右時(shí)會(huì )由于銅缺乏而死亡。后續研究證明“毒乳”為ATP7B基因突變小鼠。

TX小鼠又分為兩種，一種是1974年由Harold Rauch在DL近交系小鼠F68代中發(fā)現的自然突變，后來(lái)（1996年）被鑒定為ATP7B基因外顯子20中4066位的A到G堿基變化，導致第八跨膜區M1356V（甲硫氨酸to纈氨酸）的改變。TX鼠于第3周開(kāi)始出現銅在臟器的沉積，首先是肝臟和腦，以肝臟為重，至第4個(gè)月銅沉積最為顯著(zhù)，可達對照組的60~80倍。同期腎臟亦有大量沉積。這種由肝至腦再到腎的銅沉積過(guò)程與WD患者的一般臨床病程相似[9]。

另一種TX小鼠是1987年在杰克遜實(shí)驗室的C3H/HeJ群體中出現的自然突變品系TX-J小鼠，現對外出售，編號001576。該突變小鼠是ATP7B基因外顯子8中2135位的G到A的堿基突變。與TX小鼠相似，TX-J小鼠與WD患者以相似的方式在肝臟中積累銅，成年純合子TX-J小鼠會(huì )發(fā)展為肝硬化。

TX和TX-J小鼠不能完全模擬WD患者，其角膜無(wú)K-F環(huán)；與WD患者的肝臟損傷也有顯著(zhù)差異；且沒(méi)有關(guān)于人類(lèi)WD母親的嬰兒銅缺乏現象的報告；另外TX小鼠缺乏明顯神經(jīng)系統癥狀，TX-J小鼠也只有輕微的行為異常。但TX和TX-J小鼠ATP7B mRNA的轉錄水平?jīng)]有明顯改變且ATP7B基因功能部分保留，并具有與WD患者相類(lèi)似的病理過(guò)程和銅生化特征，同時(shí)也由于其容易獲得，是目前使用最多的WD動(dòng)物模型之一，廣泛應用于一些治療藥物的試驗。

2. ATP7B基因修飾小鼠

利用同源重組技術(shù)或CRISPR基因編輯技術(shù)敲除ATP7B基因第2外顯子獲得的ATP7B-/-基因敲除小鼠也越來(lái)越多的被用于WD研究。ATP7B-/-基因敲除小鼠具有與人類(lèi)WD和TX小鼠相似的銅沉積表型，但與TX鼠模型相比發(fā)病較早且肝損傷更嚴重，肝炎、壞死性炎癥、膽管增殖、纖維化，甚至后續的腫瘤發(fā)生等癥狀都比TX鼠更接近人類(lèi)WD的肝臟病理結果。

隨著(zhù)基因編輯技術(shù)的進(jìn)展，采用基因編輯工具CRISPR/Cas9+ssDNA[10]，或采用堿基編輯（Base Editor）、先導編輯（Primer editor）技術(shù)，結合胚胎操作術(shù)可以較輕松地在小鼠ATP7B基因上構建與人類(lèi)WD同源的突變位點(diǎn)。理論上可以獲得更接近人類(lèi)WD特征的小鼠模型。

3. LEC(Long–Evans Cinnamon)大鼠

LEC大鼠是一種近交系突變大鼠，最初是從Long–Evans大鼠群體中分離出來(lái)的，它的ATP7B基因在3’端編碼區缺失了900個(gè)堿基，以及下游未翻譯區缺失了約400個(gè)堿基。LEC大鼠主要表現出自發(fā)性肝銅異常積聚伴隨低血清銅和低銅藍蛋白，大約4月齡時(shí)出現暴發(fā)性肝炎或暴發(fā)性肝衰竭、轉氨酶和膽紅素升高，部分或大量肝細胞壞死，病死率至少30%～40%，存活下來(lái)的大鼠多在12月齡時(shí)發(fā)生肝纖維化并伴有肝細胞癌和膽管癌。由于肝病進(jìn)展迅速，LEC大鼠特別適合干預治療研究，如各種排銅絡(luò )合劑和干細胞治療研究等。

圖3. LEC(Long–Evans Cinnamon)大鼠

4. 其他大型哺乳動(dòng)物模型

一些大型哺乳動(dòng)物在銅代謝方面也存在遺傳缺陷，均表現出銅在肝臟中積累和銅毒性，例如犬(杜賓犬、拉布拉多尋回犬、貝靈頓梗犬Bedlington Terrier)和北羅納德賽羊等。然而這些大型哺乳動(dòng)物銅代謝方面的遺傳缺陷與人類(lèi)WD并不相同，如貝靈頓梗犬，導致其肝銅積累的遺傳缺陷是由于COMMD1（MURR1）基因39.7kb的刪除，而非ATP7B基因，故作為人類(lèi)WD模型的作用有其局限性[11, 12]。若能在大型哺乳動(dòng)物甚至非人靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物的ATP7B基因中引入突變，或將造就更好模擬人類(lèi)WD的動(dòng)物模型。

05、肝豆狀核變性的治療

在目前的治療方案中，WD患者需進(jìn)行終生治療，主要目標為治療銅過(guò)載。基本原則包括低銅飲食：避免或限制富含銅的食物，如肝臟、水生貝殼類(lèi)動(dòng)物、堅果、巧克力、豆類(lèi)、蘑菇等。藥物治療方面以青霉胺、曲恩汀為代表的金屬絡(luò )合劑增加銅的排除，以鋅劑為代表的藥物減少銅的吸收。治療越早越好，患者通常不能停藥，因為治療中斷很可能導致失代償性肝損傷及神經(jīng)不可逆損傷。

值得注意的是WD的藥物治療有一定的局限性，除需要終生治療外，約1/3 WD患者用藥期間會(huì )出現與藥物相關(guān)的不良事件，導致不得不更換藥物，甚至可能導致治療失敗，WD晚期導致的肝衰竭或失代償期肝硬化需要進(jìn)行肝移植，這可能是最后的常規治療手段。

鑒于WD是非常明確的由ATP7B基因突變所致的疾病，因此基因治療或許有廣闊的前景。目前已有基于動(dòng)物模型的WD基因治療研究。如Murillo等在研究中用編碼人ATP7B cDNA的AAV8載體轉導到ATP7B-/-小鼠模型的肝臟，發(fā)現治療后血清轉氨酶降低，尿銅排泄量減少，血清全血漿蛋白的正常化[13]。此外，2019年Liu等通過(guò)CRISPR/Cas9替換了小鼠模型中ATP7B基因的第8外顯子[14]；2020年Michael等使用CRISPR/Cas9+ssODN的方法糾正人類(lèi)細胞系中的ATP7B點(diǎn)突變[15]。筆者嘗試用一種ABE堿基編輯器輸入到TX-J小鼠肝臟，觀(guān)察到了小鼠血清轉氨酶降低，以及低比例的肝細胞ATP7B點(diǎn)突變被糾正（數據不展示）。總之，基因治療的進(jìn)展為WD患者帶來(lái)了希望，但基因治療還處于基礎研究到臨床研究轉化的階段，還有很多不成熟的地方需要不斷完善和革新。期望它將來(lái)能成為治療肝豆狀核變性的一線(xiàn)療法。

參考文獻：

1.Wilson, S.A.K., Progressive lenticular degeneration. A familial nervous disease associated with cirrhosis of the liver. Lancet, 1912. 1: p. 1115-1119.

2.Gomes, A. and G.V. Dedoussis, Geographic distribution of ATP7B mutations in Wilson disease. Annals of Human Biology, 2016. 43(1): p. 1-8.

3.Rodriguez-Castro, K.I., F.J. Hevia-Urrutia, and G.C. Sturniolo,Wilson’s disease: A review of what we have learned. World journal of hepatology, 2015. 7(29): p. 2859.

4.Ari?z, C., Y.Z. Li, and P. Wittung-Stafshede, The six metal binding domains in human copper transporter, ATP7B: molecular biophysics and disease-causing mutations. Biometals, 2017. 30(6): p. 823-840.

5.Liver, E.A.F.T.S.O.T., EASL clinical practice guidelines: Wilson’s disease. Journal of hepatology, 2012. 56(3): p. 671-685.

6.Guggilla, S.R., et al., Spectrum of mutations in the ATP binding domain of ATP7B gene of Wilson Disease in a regional Indian cohort. Gene, 2015. 569(1): p. 83-87.

7.Hedera, P., Update on the clinical management of Wilson’s disease. The application of clinical genetics, 2017. 10: p. 9.

8.黃艷，劉志峰, 肝豆狀核變性ATP7B基因突變的研究進(jìn)展.醫學(xué)綜述, 2019. 025(009): p. 1717-1721.

9.Harold and Rauch, Toxic milk, a new mutation affecting copper metabolism in the mouse. J Hered, 1983. 74(3): p. 141-144.

10.朱基彥, et al., 利用CRISPR/Cas9構建R778L類(lèi)型肝豆狀核變性疾病小鼠模型.基礎醫學(xué)與臨床, 2018. 38(12): p. 6.

11.楊玉龍, et al., 肝豆狀核變性動(dòng)物模型的研究進(jìn)展.臨床肝膽病雜志, 2022. 38(5): p. 6.

12.Fieten, H., et al., New canine models of copper toxicosis: diagnosis, treatment, and genetics. Human Disorders of Copper Metabolism I, 2014. 1314: p. 42-48.

13.Murillo, O., et al., Long-term metabolic correction of Wilson's disease in a murine model by gene therapy. Journal of Hepatology, 2016. 64(2): p. 419-426.

14.Liu, L.L., et al., Exon Replacement in the Mouse Gene by the Cas9 System. Human Gene Therapy, 2019. 30(9): p. 1079-1092.

15.P?hler, M., et al., CRISPR/Cas9-mediated correction of mutated copper transporter ATP7B. Plos One, 2020. 15(9).