肌萎縮性脊髓側索硬化癥

因中樞神經(jīng)系統內控制骨骼肌運動(dòng)的神經(jīng)元退化導致的肌萎縮性脊髓側索硬化癥（Amyotrophic lateral sclerosis： ALS，也稱(chēng)漸凍人癥）是一種漸進(jìn)且致命的神經(jīng)退行性疾病。由于運動(dòng)神經(jīng)元退化和死亡，肌肉逐漸萎縮致大腦完全喪失控制隨意運動(dòng)的能力，最終會(huì )造成發(fā)音、吞咽，以及呼吸和運動(dòng)障礙。著(zhù)名物理學(xué)家霍金就是一名ALS患者。目前還沒(méi)有真正可有效治療ALS的藥物和方法。

絕大多數（90-95%）的ALS發(fā)病原因不明，但也有約5-10%的ALS患者表現出了家族遺傳性，其中超氧化物歧化酶 1（Superoxide Dismutase 1：SOD1）基因突變約占這些遺傳性ALS病例的10%。SOD1也是第一個(gè)被鑒定出來(lái)的ALS風(fēng)險基因[1]，因此很快就有科學(xué)家構建了一種含有第93位甘氨酸突變?yōu)楸彼幔℅93A）的人SOD1基因的轉基因小鼠模型，全名為B6SJL-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J轉基因小鼠[2]。該轉基因小鼠基因組中被轉入了23個(gè)拷貝的人源SOD1*G93A突變基因，接下來(lái)我們將其簡(jiǎn)稱(chēng)SOD1*G93A轉基因小鼠。

圖二：SOD1*G93A轉基因小鼠是以B6和SJL雜交子代為背景品系，通過(guò)原核注射和胚胎移植得到的轉基因小鼠模型，因此其毛色多樣，圖片來(lái)自Jax實(shí)驗室（https://www.jax.org/strain/002726）

自1996年SOD1*G93A轉基因小鼠問(wèn)世以后，其就被廣泛應用于A(yíng)LS藥物研發(fā)的臨床前動(dòng)物試驗中。到2004年，短短8年時(shí)間內，已至少有50篇文章描述了從小分子到病毒載體的各類(lèi)ALS治療方案，可延長(cháng)SOD1*G93A轉基因小鼠的壽命，其中最長(cháng)可以延長(cháng)壽命100天（78%的壽命延長(cháng)）。這些藥物很快進(jìn)入臨床試驗，然而，迄今為止，除了利魯唑（最多延長(cháng)ALS患者兩個(gè)月壽命）之外，沒(méi)有任何一種藥物顯示出對人類(lèi)ALS疾病的進(jìn)程有顯著(zhù)影響[3]。這給醫藥公司帶來(lái)了巨大損失，如2008年在美國國家科學(xué)院院刊上發(fā)表的一篇文章顯示鋰可以將SOD1*G93A轉基因小鼠的存活時(shí)間延長(cháng)30天[4]。由于鋰早已經(jīng)被用于治療精神分裂癥，許多ALS患者開(kāi)始超說(shuō)明書(shū)服用該藥物，希望減緩疾病進(jìn)程。然而，招募了數百名患者，花費了遠超1億美元的三個(gè)同時(shí)啟動(dòng)的獨立III期臨床試驗結果卻顯示鋰對ALS無(wú)任何治療效果。

其實(shí)不僅僅是ALS的藥物研發(fā)，在整個(gè)醫藥研發(fā)領(lǐng)域，動(dòng)物實(shí)驗結果的平均臨床轉化率也是非常低的，平均在11%左右  。那么到底是什么原因導致了如此高比例的動(dòng)物實(shí)驗結果無(wú)法實(shí)現在人類(lèi)的臨床轉化呢？

1999年，美國麻省理工學(xué)院的機械工程師詹姆斯·海伍德在得知他的哥哥史蒂芬·海伍德被確診患有ALS，并無(wú)任何有效治療方法后，與家人一起創(chuàng )立了一家非盈利性生物技術(shù)公司，即ALS 治療開(kāi)發(fā)研究所 (ALS-TDI)。ALS-TDI成立后開(kāi)展了一項旨在尋找SOD1*G93A轉基因小鼠實(shí)驗結果臨床轉化失敗原因的項目，即使用SOD1*G93A轉基因小鼠重復已發(fā)表科研論文中的動(dòng)物實(shí)驗，以找出其臨床轉化失敗的原因。

在A(yíng)LS-TDI開(kāi)展的重復性實(shí)驗中，他們不僅嚴格執行盲法對照，而且對給藥組和對照組的動(dòng)物進(jìn)行了更為精細的分配和動(dòng)物篩查以排除系統誤差。他們分組及實(shí)驗要求包括：

⑴ 年齡匹配；

⑵ 性別匹配；

⑶ 同窩匹配：即使用同一天出生的同一非轉基因母親和轉基因父親的后代進(jìn)行分組，具體來(lái)說(shuō)，治療組中的每個(gè)雄性（和雌性）在對照組中都有一個(gè)同窩兄弟（和姐妹）；

⑷ 樣本量設定：每組使用動(dòng)物數量為24只（12雌，12雄）；

⑸ 死因篩查：檢查記錄每一只動(dòng)物的死亡原因，排出非ALS致死個(gè)體；

⑹ 轉基因拷貝數監控：有研究證明SOD1*G93A轉基因小鼠在傳代過(guò)程中會(huì )出現轉基因拷貝數丟失的現象，且低拷貝的轉基因小鼠的平均壽命會(huì )加長(cháng)。

在這一嚴格實(shí)驗分組和動(dòng)物篩查條件下，ALS-TDI的科研人員總共使用了5429只SOD1*G93A轉基因小鼠測試了包括利魯唑在內的100多種（大部分已有論文發(fā)表并證明可延長(cháng)SOD1*G93A轉基因小鼠壽命）候選化合物，卻沒(méi)有發(fā)現任一化合物表現出可延長(cháng)SOD1*G93A轉基因小鼠壽命的效果（圖三）。

圖三：ALS-TDI以SOD1*G93A轉基因小鼠開(kāi)展的重復實(shí)驗結果與已發(fā)表實(shí)驗結果對比[3]

為找出導致那些已經(jīng)發(fā)表實(shí)驗結果無(wú)法被重復的原因，他們以在A(yíng)LS-TDI開(kāi)展實(shí)驗中所使用的2000多只對照小鼠作為研究對象，進(jìn)行了計算機分組模擬實(shí)驗。由于這些小鼠從出生到死亡及死亡原因的信息在A(yíng)LS-TDI都有詳細的記錄，因此他們能夠以所有對照小鼠為數據庫，分析前述重復實(shí)驗中設定的不同分組和動(dòng)物篩查條件對實(shí)驗結果的影響。即通過(guò)計算機對這些沒(méi)有經(jīng)過(guò)任何藥物處理的小鼠進(jìn)行分組，將一組設為假定的實(shí)驗組，而另一組設為假定的對照組，然后依據已有的小鼠死亡時(shí)間記錄，統計兩組小鼠之間是否存在顯著(zhù)差異。經(jīng)過(guò)多次重復，計算出現5%以上顯著(zhù)差異的百分比。由于這些對照小鼠沒(méi)有接受過(guò)任何化合物處理，因此如果假定的實(shí)驗組和對照組中出現了顯著(zhù)性差異，那么其來(lái)源應該是分組時(shí)的系統誤差。

結果顯示，在樣本量大小為4的計算機分組模擬對比實(shí)驗中，在隨機分組和不進(jìn)行死因篩查及排除低轉基因拷貝數個(gè)體條件下，兩組間出現顯著(zhù)差異的可能性超過(guò)了50%。而隨機分組的同時(shí)進(jìn)行死因篩查并排除低轉基因拷貝數個(gè)體和進(jìn)行性別匹配的分組條件下，樣本量為4的模擬分組實(shí)驗中也有30%的可能出現兩組死亡時(shí)間的顯著(zhù)差異（圖四）。隨著(zhù)樣本量的增加，出現顯著(zhù)性差異的可能性逐漸減少，但要實(shí)現低于5%（統計學(xué)上通常設置的顯著(zhù)置信區間）的顯著(zhù)性差異，樣本量要達到每組24只動(dòng)物。如果不做分組條件控制，即使樣本量到50只也難以排除系統誤差。

圖四：分組條件導致的系統誤差[3]

ALS- TDI的這個(gè)計算機模擬實(shí)驗結果說(shuō)明，前述那些已經(jīng)發(fā)表的基于SOD1*G93A轉基因小鼠實(shí)驗結果無(wú)法實(shí)現臨床轉化的真正原因極大可能源于其實(shí)驗設計的不合理。這些實(shí)驗因為沒(méi)有排除分組時(shí)的系統誤差而導致了假陽(yáng)性結果。這個(gè)研究也暴露了當下使用實(shí)驗動(dòng)物開(kāi)展研究的諸多問(wèn)題，如盲目地追求減少使用動(dòng)物的數量；對所用動(dòng)物遺傳、微生物和繁殖等特性不了解；實(shí)驗過(guò)程中對動(dòng)物關(guān)注不夠，不清楚動(dòng)物發(fā)病或死亡的真正原因等。這些問(wèn)題不僅僅需要引起實(shí)驗動(dòng)物從業(yè)人員的注意，科研人員同樣需要給予關(guān)注。因為實(shí)驗設計不嚴謹導致的假陽(yáng)性結果不僅是人力、物力和財力的巨大浪費，也嚴重有違動(dòng)物實(shí)驗倫理福利，這樣的實(shí)驗不會(huì )帶來(lái)科學(xué)進(jìn)步，且浪費了大量實(shí)驗動(dòng)物的生命。比如在A(yíng)LS-TDI開(kāi)展的無(wú)法重復出已發(fā)表結果的實(shí)驗中，那些已經(jīng)發(fā)表的工作累計使用小鼠的數量就超過(guò)了18000只。此外，在動(dòng)物實(shí)驗倫理申請時(shí)常用替代、優(yōu)化和減少（俗稱(chēng)3R原則）原則來(lái)指導倫理審查工作，有時(shí)為了滿(mǎn)足3R原則中的“減少”原則，加上開(kāi)展實(shí)驗成本的考慮，往往選擇使用最少的動(dòng)物數量（比如多為每組6只），但從ALS-TDI的這個(gè)研究看，樣本量過(guò)小，會(huì )導致系統誤差加大，因此極大可能出現假陽(yáng)性結果。這個(gè)時(shí)候大家或許忘了3R原則使用的大前提是要能夠實(shí)現擬開(kāi)展實(shí)驗的科學(xué)目標，如果單純?yōu)榱恕皽p少”而使用更少的實(shí)驗動(dòng)物導致科學(xué)目標無(wú)法實(shí)現，那不是減少，而是對動(dòng)物生命的漠視。

參考文獻：

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