基于FELASA實(shí)驗小鼠遺傳質(zhì)量控制和遺傳檢測工作組的報告，本公眾號前期文章《實(shí)驗大小鼠的遺傳質(zhì)量控制和遺傳監測: 標準化實(shí)驗大小鼠分類(lèi)》一文介紹了常見(jiàn)標準化嚙齒類(lèi)動(dòng)物和幾種獲得遺傳工程嚙齒動(dòng)物的基本方法。本文將繼續依據該報告的內容，重點(diǎn)介紹如何進(jìn)行小鼠遺傳質(zhì)量控制和遺傳監測。

當你的設施有新構建或者引入一種GA（Genetically altered）嚙齒類(lèi)動(dòng)物時(shí)，應完整記錄這些動(dòng)物的詳細信息。同時(shí)，這些信息也必須伴隨著(zhù)相應動(dòng)物品系一起傳遞給所有可能會(huì )使用它的研究者。這些信息包括但不限于：正確的品系名稱(chēng)、對于突變的完整描述、動(dòng)物的遺傳背景、基因鑒定方案和相關(guān)表型描述等。設施管理者可以設計一些固定格式的表格用于記錄這些信息。

關(guān)于命名法重要性的概述，可以參考“FELASA轉基因嚙齒動(dòng)物生產(chǎn)和命名指南”。沒(méi)有一個(gè)公認的命名法，就不可能準確地交流科學(xué)成果。同時(shí)模糊或不完整的命名會(huì )引發(fā)錯誤，會(huì )使實(shí)驗結果的可重復性降低。因此，應根據國際命名規則命名不同品系。特別是當同一品系被保存在世界各地不同的設施或它們被加入數據庫中時(shí)，這一點(diǎn)顯得尤為重要。指導命名的規則由國際小鼠和大鼠標準化遺傳命名委員會(huì )制定，并不斷更新。這些規則最近一次修訂是在2016年1月，在MGI網(wǎng)頁(yè)的“小鼠和大鼠品系命名指南”中有詳細描述。

遺傳變異的來(lái)源

嚙齒類(lèi)動(dòng)物設施面臨的一個(gè)重要挑戰是保持近交系的遺傳背景純正，并將GA系動(dòng)物維持在明確的遺傳背景之下。近交系的遺傳變異可能由以下因素產(chǎn)生：（a）意外的雜交造成的污染；（b）由于殘留的雜合性或新的自發(fā)突變的固定造成的遺傳漂變。遺傳變異的引入通常有以下幾種途徑：

（1）遺傳污染

來(lái)自一個(gè)近交系的個(gè)體與另一個(gè)來(lái)源的動(dòng)物意外交配導致的基因污染是近交系中遺傳譜系改變的最重要來(lái)源。這種類(lèi)型的基因污染會(huì )導致等位基因發(fā)生突然的大規模改變，尤其在具有相同被毛顏色的品系中更容易發(fā)生，例如帶有白化等位基因(Tyrc /Tyrc )、agouti(A/A)或非agouti(a/a)的品系之間。因此在飼養具有相同被毛顏色的不同品系動(dòng)物時(shí)需要格外小心，盡可能防止其近距離接觸。有關(guān)小鼠毛色遺傳，可參閱本號前文《小鼠的毛色是如何形成的？》

（2）自發(fā)突變

自發(fā)突變是在個(gè)體中由于自然存在的誘變劑或DNA復制、轉錄、修復時(shí)偶然出現的堿基配對錯誤而產(chǎn)生的突變，是一種不受控制的遺傳變異來(lái)源，通常無(wú)法通過(guò)簡(jiǎn)單的表型觀(guān)察或者常規的遺傳監測發(fā)現。

（3）遺傳漂變

遺傳漂變是指某個(gè)小群體中，由于新突變的出現以及殘留雜合性的等位基因逐步固化在純合狀態(tài)，并取代了原來(lái)的等位基因的過(guò)程。

當同一品系在不同地方獨立繁殖時(shí)，遺傳漂變對品系的分化和亞品系的產(chǎn)生有不可忽視的作用。小鼠亞品系的例子很多，例如，已發(fā)現有10個(gè)有記錄的BABL/c亞系和15個(gè)C57BL/6亞系，包括來(lái)自杰克遜實(shí)驗室的C57BL/6J和來(lái)自美國國立衛生研究院（NIH）的C57BL/6N亞系。同樣，許多大鼠近交系也至少有兩個(gè)亞系，例如SHR至少有四個(gè)亞系，包括SHR/Ola和SHR/NCrl；WKY和F344至少各有三個(gè)亞系。

（4）乘客突變

乘客突變是指隱藏在亞系或者是GA系動(dòng)物的基因組中的突變，這些突變在某些特定情況下能夠影響到動(dòng)物實(shí)驗結果。例如在最常見(jiàn)的C57BL/6中的兩個(gè)亞系C57BL/6J和C57BL/6N，由于一些自發(fā)的突變，如C57BL/6N中出現了可導致視網(wǎng)膜退變的Crb1rd8突變，而C57BL/6J中則出現了Nnt基因的缺失。正因這類(lèi)乘客突變的存在，在進(jìn)行表型分析時(shí)，要特別注意觀(guān)察到的表型是由于目標基因的修飾還是遺傳背景中存在的突變造成的，并藉此選擇合適的對照組動(dòng)物。

遺傳質(zhì)量控制方案

目前實(shí)驗嚙齒類(lèi)動(dòng)物的遺傳質(zhì)量控制金標準是依靠遺傳標記多態(tài)性來(lái)區分不同的遺傳背景。

遺傳標記是染色體上已知位置的特定DNA序列，是遺傳質(zhì)量控制的基本工具。遺傳質(zhì)量控制對確定動(dòng)物的遺傳組成，確定品系的一致性和真實(shí)性是必要的。值得注意的是，一般不會(huì )對封閉群動(dòng)物進(jìn)行遺傳標記一致性的檢測，相反，應該對封閉群動(dòng)物的遺傳異質(zhì)性水平進(jìn)行確認，以檢測遺傳污染，監測育種方案的科學(xué)性。

標記系統

大鼠和小鼠中已經(jīng)發(fā)現多種多態(tài)性，然而，在目前的質(zhì)量保證方案中，只有微衛星DNA和SNPs被用作遺傳標記物。微衛星標記，又被稱(chēng)為短串聯(lián)重復序列(short tandem repeats,STRs)或簡(jiǎn)單重復序列（simple sequence repeats，SSR），是均勻分布于真核生物基因組中的簡(jiǎn)單重復序列，其典型結構是由2～6個(gè)核苷酸的序列串聯(lián)重復幾次到幾十次構成，這種重復造就了染色體之間的等位基因多樣性。微衛星標記通常先通過(guò)PCR方式擴增包含微衛星序列的區域，再對擴增產(chǎn)物通過(guò)電泳分析和片段大小進(jìn)行等位基因差異分析。

SNP分型是微衛星標記的一種替代方法，現在應用范圍更廣。SNP多態(tài)性是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，編碼區和非編碼區都有SNP的存在。

杰克遜實(shí)驗室的Petkov和他的同事從48個(gè)小鼠品系中的235個(gè)SNPs的等位基因中選擇了28個(gè)SNP，這些位點(diǎn)已足以區分杰克遜實(shí)驗室所保存的約300個(gè)近交系、野生型、同類(lèi)系、染色體置換系和重組近交系中的大多數動(dòng)物。一些研究者也報道了大鼠可用的SNPs。例如，Zimdahl和他的同事描述了來(lái)自轉錄區的超過(guò)12,000個(gè)SNPs。

近交系和遠交系的遺傳監測

目前（在歐美國家）使用的主流的遺傳監測技術(shù)是基于微衛星或SNPs 的檢測。然而，我們建議，除了分子技術(shù)，同時(shí)也應該監測動(dòng)物的表型參數，如毛色、行為和繁殖能力等。商業(yè)育種者對控制遺傳污染的發(fā)生應更為重視，并定期監測其品系的遺傳質(zhì)量。杰克遜實(shí)驗室采用了一種獨特的、已獲專(zhuān)利的遺傳穩定計劃，即通過(guò)每五代就重新從純種的、冷凍的胚胎中重建他們的基礎種群來(lái)有效地限制遺傳漂變的積累。例如，從2005年開(kāi)始，他們出售的C57BL/6J小鼠都是兩只選定的小鼠的后代，而他們冷凍的數百個(gè)胚胎足以持續使用25-30年。特別需要注意的是，當從冷凍庫存中復蘇胚胎時(shí)，也應進(jìn)行遺傳檢測，以確保冷凍前及冷凍過(guò)程中沒(méi)有發(fā)生遺傳污染或其他錯誤。

對于遠交系，遺傳監測有助于保持群體的遺傳多樣性和等位基因庫。這個(gè)過(guò)程更為復雜，需要分析大量的動(dòng)物，并將這些數據與歷史數據進(jìn)行比較，記錄存在的等位基因、它們的頻率和該特定群體的雜合度水平。在某些情況下遺傳多樣性缺失的結果會(huì )導致一個(gè)群體的異質(zhì)性降到較低水平。低異質(zhì)性可能是源于繁殖種群的選擇不當，繁育體系執行中的偏離，或是起始的繁殖群體過(guò)小。相反，過(guò)高的異質(zhì)性可能是由近期出現的遠交造成的。大體上，需通過(guò)測量表型性狀和計算相應的平均值和標準差來(lái)描述遠交系的基本特征。對遠交系遺傳控制的原則是避免近親繁殖并在各代中保持其遺傳多樣性。

自繁近交系小鼠和大鼠的遺傳監測

建議從可靠的供應商購處買(mǎi)動(dòng)物，并在10代后用同一供應商的動(dòng)物替換繁殖種群，不建議長(cháng)期維持經(jīng)典近交品系的獨立種群。使用來(lái)自同一供應商的動(dòng)物可以有效的防止產(chǎn)生突變的亞品系。同時(shí)，自繁動(dòng)物也應該用微衛星標記或SNPs檢測進(jìn)行遺傳質(zhì)量監測，以確保其遺傳質(zhì)量的可靠性。

微衛星檢測可以用于驗證近交系小鼠品系背景的純度，是否有遺傳污染的痕跡。這對于在同一飼養間內飼養具有相同毛色的品系的動(dòng)物設施，尤其是在不使用IVC籠具的設施來(lái)說(shuō)尤其重要。微衛星檢測的標記物數量尚未標準化，標記物的選擇應根據設施維持品系的種類(lèi)和數量進(jìn)行相應的調整。

由于近交系動(dòng)物的基因序列高度一致，基因都是純合的，當對一個(gè)特定的微衛星位點(diǎn)進(jìn)行基因分型的時(shí)候，在電泳時(shí)只會(huì )呈現單一條帶，代表一個(gè)等位基因，而任何雜合性的存在，例如有兩個(gè)條帶或者與對照組條帶大小不一致時(shí)，就應該被視為有潛在的污染（圖1）。

圖1. 通過(guò)SSLP PCR檢測基因污染的例子

圖片是PCR擴增后得到的特征條帶，這些條帶來(lái)自四只據稱(chēng)屬于BALB/c品系的小鼠的基因組DNA(每組的前四個(gè)泳道)，加上BALB/c的標準DNA對照(最后一個(gè)泳道)。本圖片只顯示了位于1至5號染色體上的五個(gè)SSLP位點(diǎn)。可見(jiàn)存在雜合性(兩條帶)和不符合BALB/c標準的條帶大小的條帶存在。

對于種群數量較小，且采用隔離飼養，也沒(méi)有高頻次動(dòng)物引進(jìn)的設施，每?jì)赡暌淮螜z測就可以有效的監測動(dòng)物遺傳質(zhì)量。

使用SNP組監測動(dòng)物遺傳質(zhì)量時(shí)，利用均勻分布在染色體上的四十多個(gè)SNPs就可以有效檢出近期發(fā)生的遺傳污染，檢測位點(diǎn)數量可根據每個(gè)機構的實(shí)際情況和設施面對的風(fēng)險程度而定。SNP基因分型目前可以在不同的平臺上進(jìn)行，其成本和自動(dòng)化能力各不相同。Kompetitive Allele Specific PCR(KASP)和Taqman實(shí)時(shí)熒光定量PCR是常用的檢測方式，相比較而言，前者的自動(dòng)化程度更高，成本更低，但對檢測樣本量的下限有一定要求。

遠交系種群的遺傳質(zhì)量監測

遠交系的遺傳質(zhì)量監測比近交系要復雜的多，因為這些動(dòng)物的基因并不一樣，它們本質(zhì)上是一群密切相關(guān)的動(dòng)物，有共同的祖先和群體特征，但表現出一定程度的遺傳多樣性，所以?xún)H僅用少量的遺傳標記就很難建立一個(gè)標準的遺傳監測方案。然而，通過(guò)監測足夠數量的SNPs或者SSLPs位點(diǎn)，就可以說(shuō)明群體內的等位基因頻率和種群的遺傳特征。

遠交系遺傳質(zhì)量控制面臨的主要問(wèn)題之一是，許多管理者用非常小規模的繁殖種群，導致種群中有代表性的等位基因數量減少，增加了近親繁殖系數，這種種群既不是真正意義上的遠交系，也不是近交系。因此，如果無(wú)法維持適當基數的繁殖種群的時(shí)候，就建議從那些有大規模繁殖種群的供應商處購買(mǎi)遠交系動(dòng)物，或者遵循推薦的繁殖方案，以減少近親繁殖。

參考文獻：

[1] Benavides F , T Rülicke,  Prins J B , et al. Genetic quality assurance and genetic monitoring of laboratory mice and rats: FELASA Working Group Report:[J]. Laboratory Animals, 2020, 54(2):135-148.